一、起步：選對(duì)細(xì)胞
原代表型貼近初始狀態(tài)，適合短期研究；連續(xù)傳代系均一性好，利于長(zhǎng)期對(duì)比。決定來(lái)源后，先查生長(zhǎng)曲線和推薦培養(yǎng)基，再規(guī)劃凍存規(guī)模，避免中途換系帶來(lái)變量。

二、培養(yǎng)基：主食與配菜
基礎(chǔ)粉末提供糖、氨基酸、維生素；添加成分宜循序漸進(jìn)：先運(yùn)行簡(jiǎn)化配方，再逐步補(bǔ)入附著因子或刺激物，可把未知變量降到最di。

三、環(huán)境：溫度、氣體、濕度三件套
36.5-37℃、5% CO?、≥90%相對(duì)濕度是常見(jiàn)設(shè)定。每日用獨(dú)立探頭校準(zhǔn)，水盤(pán)用純水，每周更換，防止膜狀沉積。低氧研究可先用氮?dú)庀抡{(diào)氧分壓，再補(bǔ)CO?，緩慢達(dá)到目標(biāo)值。

四、接種與換液
貼壁細(xì)胞以次日30-40%覆蓋度為宜；懸浮細(xì)胞0.3-0.5×10?/mL起步，過(guò)高易早接觸抑制。換液間隔48-72 h，顏色變黃即提前處理，減少代謝廢物累積。

五、傳代與凍存
80-90%融合即可消化；先短后長(zhǎng)找“剛好脫落"時(shí)間點(diǎn)，可降低酶過(guò)度暴露。凍存密度1-2×10?/mL/管，程序降溫盒-80℃過(guò)夜再入液氮，復(fù)蘇存活率常>90%。

六、監(jiān)測(cè)：形態(tài)+數(shù)據(jù)雙保險(xiǎn)
每日相差顯微鏡拍照，記錄邊緣圓潤(rùn)度；結(jié)合實(shí)時(shí)阻抗或比色法，可量化倍增速率。發(fā)現(xiàn)圓縮、拉絲或成團(tuán)，先排查換液頻率、CO?濃度，再查看試劑批號(hào)。

七、清潔與防污染

1.       空白對(duì)照：每批設(shè)“僅培養(yǎng)基"瓶，48 h觀察渾濁度。

2.       表面快檢：ATP擦拭≤30 RLU通過(guò)，>100 RLU立即重清潔。

3.       分裝邏輯：血清、酶類(lèi)按單次用量冷凍，避免整瓶反復(fù)升溫。

八、數(shù)據(jù)與重復(fù)
同一實(shí)驗(yàn)三次獨(dú)立運(yùn)行，時(shí)間、試劑、操作者各自分開(kāi)；電子原始記錄自動(dòng)時(shí)間戳，圖像分文件夾存放，硬件損壞也不丟數(shù)據(jù)。

九、持續(xù)改進(jìn)
月度自查：設(shè)備校準(zhǔn)、清潔記錄、耗材庫(kù)存三表合一；年度外部查看，出具改進(jìn)清單，逐條回復(fù)關(guān)閉。把規(guī)范變成默認(rèn)，結(jié)果自然穩(wěn)健。

細(xì)胞培養(yǎng)沒(méi)有魔法配方，只有被驗(yàn)證的細(xì)節(jié)。當(dāng)校準(zhǔn)、記錄、清潔成為肌肉記憶，培養(yǎng)瓶里便會(huì)給出穩(wěn)定、可重復(fù)的生長(zhǎng)曲線，為下游功能研究奠定扎實(shí)基礎(chǔ)。